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特殊培養法

發布時間:2021-04-09 17:38:29

1)二倍體細胞培養法

二倍體細胞培養法與一般培養相同,關鍵在于傳代,其傳代程序為:

1. ? ? ?吸除舊培養液注入另瓶中。

2. ? ? ?用溫BSS沖洗1次。

3. ? ? ?用0.25%溫胰蛋白酶消化,加入消化液量以僅覆蓋細胞層即可;作用1~5分鐘。

4. ? ? ?待細胞附著松動、細胞質邊緣卷起和間隔加大,便終止消化。為防止細胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養液(新舊培養液按2:1新舊混合)。

5. ? ? ?輕輕反復吹打制成單個細胞懸液。

6. ? ? ?按一分為二比例接種培養。

2)支持物培養法

加支持物培養法與一般培養法相同,只是在培養前需在培養瓶中加入已經消毒的支持物。

1. ? ? ?支持物制備:如用特氟隆薄膜,無菌條件下啟封,用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊,于培養接種細胞前,先置入培養容器中即可;通常多用蓋玻片做支持物,用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態,以便裝入培養瓶中,然后按如下順序處理:自來水浸泡24小時—96%酒精30~60 min—蒸餾水浸泡30~60 min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養皿中—高壓或干熱滅菌備用。

2. ? ? ?培養法:初代消化培養、初代組織塊培養、傳代培養等皆可應用加支持物培養法。接種細胞后,可在任何時間取出支持物,做各種觀察或實驗。

3)細胞分離(克?。┡囵B

多孔塑料培養板單細胞克隆法:

1. ? ? ?消化:取健康待克隆細胞,吸出瓶內培養液,加消化液。

2. ? ? ?低密度細胞懸液的制備:做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液,然后稀釋細胞,使之成為1~2細胞/毫升懸液,最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養液。

3. ? ? ?接種:先用吸管輕輕吹打細胞懸液,使混懸均勻,繼用加樣器向塑料培養板每孔內加0.5毫升。接種時要迅速準確,爭取在最短時間內加完,以免培養液蒸發,然后迅速蓋好蓋板,置CO2溫箱培養。

4. ? ? ?標記:培養6~12小時后,待細胞下沉冰貼附于培養板孔底后,從溫箱中取出,置倒置光顯微鏡臺上,觀察和標記下含有單個細胞的孔,置CO2溫箱培養。在培養中一般無需換液,只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養基,但不要吸除過多,余少許,以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養液,繼續培養3~4周。待孔內細胞增至500~600個時,可進行分離培養。

5. ? ? ?分離擴大培養:培養86~96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔,先吸除舊培養液,用Hanks洗1~2次,繼加胰蛋白酶少許,加入量已能覆蓋細胞群即可,如過多,應吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視,待發現細胞變圓時,加入0.1ml含10%血清的克隆培養基,用吸管輕輕吹打,當細胞離開底物懸浮后,一并吸入管內,移入另瓶或皿中,再補加一定量克隆培養液,置CO2溫箱中繼續培養、增殖,使之形成新的細胞群后,即轉用常規培養法培養。

必須保證分離出來的細胞確為一個而不是兩個或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功,為此常采取以下一些措施:

使用適應性培養基或條件培養基(Conditional Medium)。制備方法:

1. ? ? ?培養同源細胞(未克隆前時的同一細胞)至半匯合狀態時,更換一次培養液,再繼續培養24~48小時后,吸出所有培養液。

2. ? ? ?離心:3000~4000/分離心10分鐘,吸取上清液。

3. ? ? ?濾過:再經直徑0.22μm濾孔的濾膜過濾,低溫凍存貯備用;用時取1分適應培養基+2分培養基混合使用。

使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法:

1. ? ? ?取原代培養的人或動物胚胎成纖維細胞,90%匯合時制成細胞懸液,再按105細胞/毫升重新接種培養。

2. ? ? ?在細胞半匯合時,準備0.25μg/ml的絲裂霉素C,按2μg/106細胞的量加入到培養瓶中過夜;或用射線單次照射,劑量30~50戈瑞。

3. ? ? ?細胞經上述處理后,Hanks液漂洗兩次、更換培養液、再培養24小時,胰蛋白酶消化細胞制成懸液,按5×104(104細胞/cm2)接種入新培養基中。

4. ? ? ?48小時后,即可用于細胞克隆之用。

底物特殊處理

1. ? ? ?制備濃度為1 mg/ml的多聚右旋賴氨酸的水溶液,用以濕潤培養瓶底。

2. ? ? ?倒出多聚賴氨酸溶液,用5ml PBS沖洗一次后,可立即使用,或存數周內使用。

4)球體細胞培養

1. ? ? ?瓊脂鋪底的培養瓶:30ml無菌培養瓶,每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養基,冷卻,形成平坦底層后備用。

2. ? ? ?取生長狀態良好已連接成片的細胞,用彎頭吸管伸入瓶內,把細胞縱橫割劃成若干小區后,倒出培養液。

3. ? ? ?加入0.25%的胰蛋白酶液,在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察,當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化,倒出消化液,用Hanks輕輕漂洗一次,加入新培養液3~5 ml,用吸管把已松動的細胞片吸打下來,分裝入1~3個含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中,置溫箱繼續培養,數日后便可生長成細胞球體。

4. ? ? ?換液:培養1~2日后,如需換液,微傾斜培養瓶,令培養液集于培養瓶底角,停片刻,待球體細胞下沉后,吸除部分培養液,再補充新培養液。

5)微載體細胞培養法

1. ? ? ?微載體選擇:先用利用三種小量微載體做培養實驗,觀察細胞在一定時間內細胞的吸著率和計算細胞數,以得到最大量細胞為佳。

2. ? ? ?水化:稱一定量的微載體放入容器中,按每克微載體加50~100ml的比例,加入無Ca2和Mg2的磷酸緩沖液(PBS),室溫下放置應不少于3小時,并不時輕微攪動,然后再用新鮮PBS洗一次。

3. ? ? ?消毒:可采用高壓蒸汽消毒,也可在水化后用70%酒精浸泡消毒,再用無菌的PBS漂洗一二次。

4. ? ? ?傳代培養:在連續進行微載體培養時,可以不必把細胞從微載體分離下來,可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進行培養細胞能移動到新載體上。如果進行其它實驗或需要分離細胞進行傳代培養時,和常規培養相同,先用EDTA+胰蛋白酶溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后,可用自然沉降法,即在室溫下靜止5分鐘,微載體將先自沉在底部,細胞大部分仍在上清中,然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時,需用孔徑為100微米的尼龍網或不銹鋼網過濾后,再離心濾過液,就可得到較純凈的細胞。

6)懸浮培養法

懸浮培養是使帖壁細胞呈懸浮狀態生長。如所需培養的細胞本身屬懸浮生長型,則無須做任何處理;在傳代時先做離心處理去除舊培養液,添加新培養液即可。但在培養帖附型細胞時,必須進行干擾細胞不能帖附,方法有二:

1.用大培養瓶增加含有鐵芯的無毒的聚苯乙烯棒,在培養中進行電磁攪拌,使細胞不能帖壁而成懸浮培養。

2.用試管培養細胞,把試管置入帶有旋轉鼓的特制溫箱中進行培養,旋轉鼓不停徐緩轉動,干擾細胞帖壁遂成懸浮培養。

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